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细菌内毒素检测

发布日期:2022-09-28 08:49:16 来源:bob棋牌娱乐 作者:bob官方平台

  。 细菌内毒素检测 目 录 1 2 3 细菌内毒素简介 细菌内毒素检查法 需要注意的问题 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 主要内容 —— 来源 —— 特性 —— 与热源的关系 —— 在药检中应用 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 主要来源 主要来自于革兰氏阴性杆菌, 主要来自于革兰氏阴性杆菌,当细菌死 亡或自溶后便会释放出内毒素,其化学成分 亡或自溶后便会释放出内毒素, 主要是脂多糖,这是一种大分子物质, 主要是脂多糖,这是一种大分子物质,分子 量约为10 其粒径约在1~ 纳米 量约为 6,其粒径约在 5纳米 。 细菌内毒素广泛存在于自然界中。 细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自 来水中含内毒素的量为1至 来水中含内毒素的量为 至100EU/ml。 。 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 主要特性(实验器材处理方法) 实验器材处理方法) 1.耐热性 1.耐热性 一般在100℃加热1小时无影响,120℃加热 小时 ℃加热 小时无影响 小时无影响, 一般在 ℃加热4小时 小时或250℃干热半 能破坏98%, %,180-200℃干热 小时或 能破坏 %, - ℃干热2小时或 ℃ 小时才能完全破坏 才能完全破坏。 小时才能完全破坏。 注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。 故:注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。 2.不耐酸碱性 2.不耐酸碱性 内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。 内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。 故:玻璃器皿用铬酸洗液浸泡 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 主要特性(实验器材处理方法) 实验器材处理方法) 3.水溶性与不挥发性 3.水溶性与不挥发性 热原能溶于水,本身不具挥发性,但能随水蒸 热原能溶于水,本身不具挥发性, 气雾滴夹带入蒸馏水中,造成污染。 气雾滴夹带入蒸馏水中,造成污染。 故:不可用湿热灭菌法处理实验器具 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 主要特性(去除内毒素方法) 去除内毒素方法) 4.滤过性 4.滤过性 原体积很小,约在1 nm之间 之间, 原体积很小,约在1~5 nm之间,故能通过除 菌滤器而进入滤液中,但不能通过石棉滤板, 菌滤器而进入滤液中,但不能通过石棉滤板,也不 能通过半透膜。 能通过半透膜。 5.吸附性 5.吸附性 能被活性炭吸附剂吸附。 能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷,因而可被某些离子交换介质吸附。 一定的电荷,因而可被某些离子交换介质吸附。 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 热源 内毒素 ? 热源=内毒素 热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使 热原指 微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使 人体发热的物质,不仅仅是细菌内毒素。 人体发热的物质,不仅仅是细菌内毒素。 但在药检的范畴, 但在药检的范畴 , 细菌内毒素是主要的热原物 可以说无内毒素就无热原, 质,可以说无内毒素就无热原,控制内毒素就是控 制热原。 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 热源检查方法简介 《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。 中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。 将一定剂量的供试品, 静脉注入家兔体内, 将一定剂量的供试品 , 静脉注入家兔体内 , 在规 定时间内, 定时间内, 观察家兔体温升 高的情况, 高的情况,以判定 供试品中所含热原 的限度是否符合规 定。 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 与热源对比内毒素检查法优势 ? 方便、快捷、经济; 方便、快捷、经济; ? 重现性好、灵敏度高; 重现性好、灵敏度高; ? 避免抗原的产生,克服生物测定的误差; 避免抗原的产生,克服生物测定的误差; 近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法, 近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法,逐渐替代了热源法 细 菌 内 毒 素 简 介 ? 在药检中的应用 细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法, 细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法, 已经广泛的被世界各国药典收载。 已经广泛的被世界各国药典收载。 ? 成品检查——药品安全性检查之一 成品检查——药品安全性检查之一 —— ? 半成品(生产过程)检查——事前质控手段,避免 半成品(生产过程)检查——事前质控手段, ——事前质控手段 造成药品成批报废 细菌内毒素检查法 ? 主要内容 ——凝胶法原理 ——凝胶法原理 ——名词及基本概念解释 ——名词及基本概念解释 ——方法学建立与验证 ——方法学建立与验证 ——结果判定 ——结果判定 细菌内毒素检查法 ? 《中国药典》批准使用方法: 中国药典》批准使用方法: 测定 方法 凝胶法 浊度法 光度测定法 显色基质法 ? 供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。 供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。 但当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法 但当测定结果有争议时,除另有规定外, 结果为准。 结果为准。 ? 本节将着重介绍凝胶法法的操作与有关原理。 本节将着重介绍凝胶法法的操作与有关原理。 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 基本原理 凝固酶原 内毒素( 内毒素(LPS) ) 激活 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白 溶解状态) 凝胶状态) (溶解状态) (凝胶状态) 细菌内毒素检查法 ? 名词解释 —鲎及鲎试剂 名词解释1— 鲎(hòu)是一种海洋节肢动物,其血液 中含有一种有核变形细胞,这种细胞的胞浆 中含有凝固酶原和凝固蛋白原。将此物质进 行提取,经低温冷冻干燥而成的生物试剂即 为鲎试剂,专用于细菌内毒素检测。 鲎试剂灵敏度(λ):能检测出内毒素标准 能检测出内毒素标准 溶液或供品溶液中的最低内毒素浓度 最低内毒素浓度。 溶液或供品溶液中的最低内毒素浓度。 细菌内毒素检查法 ? 名词解释 —国家标准品及工作标准品 名词解释2— 国家标准品: 单位:EU/ml) 国家标准品: (单位:EU/ml) 自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、 自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、 仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的 效价; 效价; 工作标准品: 工作标准品: 经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符 复核、干扰试验及各种阳性对照; 复核、干扰试验及各种阳性对照; 细菌内毒素检查法 ? 名词解释 —细菌内毒素检查用水 名词解释3— 凝胶法: 凝胶法: 内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水; 内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水; 0.015EU/ml的灭菌注射用水 故:灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水 灭菌注射用水≠ 光度法: 光度法: 内毒素含量应小于0.005EU/ml; 内毒素含量应小于0.005EU/ml; 0.005EU/ml 细菌内毒素检查法 ? 基本概念 —细菌内毒素限值(L) 基本概念1—细菌内毒素限值( ) 指人对药品中细菌内毒素所能耐受的不致引起热原反应的 某定量限值( 某定量限值(L); 计算公式: 计算公式: L=K/M K:每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量,注射剂K=5EU/ /(kg.h) 每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量,注射剂K=5EU/ M:每公斤体重每小时的最大供试品剂量; M:每公斤体重每小时的最大供试品剂量; 每公斤体重每小时的最大供试品剂量 以胸腺素α1计算限值为例: 以胸腺素 计算限值为例: 计算限值为例 L=5EU/ (kg.h) ÷(1.6mg÷60kg)=185.19 EU/mg ÷ 药典规定标准:小于 药典规定标准:小于10EU/ml 细菌内毒素检查法 ? 基本概念 —样品最大有效稀释倍数(MVD) 基本概念2—样品最大有效稀释倍数(MVD) 指供试品溶液被允许稀释的最大倍数, 指供试品溶液被允许稀释的最大倍数,在不超过此稀 释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测; 释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测; 计算公式: 计算公式: MVD=cL/ λ λ:鲎试剂灵敏度 L:供试品的细菌内毒素限值 供试品的细菌内毒素限值 c:供试品溶液的浓度 以胸腺素α1计算最大稀释倍数为例: 以胸腺素 计算最大稀释倍数为例: 计算最大稀释倍数为例 MVD=10EU/mg×1.6mg/ml ÷0.25EU/ml=64(倍) × ( 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 方法学建立步骤 计算样品的内毒素限值(L) 计算样品的内毒素限值( 选择合适的鲎试剂 计算最大有效稀释倍数 方法学验证实验(灵敏度、干扰试验)(详见后) 方法学验证实验(灵敏度、干扰试验)(详见后) )(详见后 供试品凝胶法检测 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 方法学验证—鲎试剂灵敏度复核试验(新购) 方法学验证—鲎试剂灵敏度复核试验(新购) 目的: 目的: 对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。 对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。 以证实操作正常无误,准确可靠和结果可信。 以证实操作正常无误,准确可靠和结果可信。 方法: 方法: 将细菌内毒素工作标准品稀释至2 、 、 将细菌内毒素工作标准品稀释至 λ、 λ、0.5 λ、0.25 λ浓 、 浓 加入到鲎试剂中,保温37℃ ,然后观察结果。 度,加入到鲎试剂中,保温 ℃1 h,然后观察结果。 结果判定: 结果判定: 内毒素标准溶液2 、 、 内毒素标准溶液 λ、 λ、0.5 λ管应均为阳性,最小浓度 管应均为阳性, ( 0.25λ)应均为阴性,本批鲎试剂可用。 应均为阴性, 应均为阴性 本批鲎试剂可用。 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 试验结果( 试验结果(阴、阳性)判定: 阳性)判定: 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 方法学验证—供试品干扰试验 方法学验证— 目的: 目的: 确证产品对方法是否存在干扰(抑制或增强),得到供试 确证产品对方法是否存在干扰(抑制或增强),得到供试 ), 品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数; 品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数; ? 方法学验证—供试品干扰试验 方法学验证— 影响因素: 影响因素: —新药检查方法建立; 新药检查方法建立; —鲎试剂批号或来源的改变; 鲎试剂批号或来源的改变; —检品生产工艺,配方,成分的改变; 检品生产工艺,配方,成分的改变; —检品关键成分来源的改变; 检品关键成分来源的改变; 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 方法学验证—供试品干扰试验 方法学验证— 试验方法: 试验方法:须选择两家以上的鲎试剂进行试验 编号 A B 内毒素浓度/ 内毒素浓度/配制内 毒素的溶液 无/供试品溶液 2λ/供试品溶液 2λ/供试品溶液 稀释 用液 — 供试品溶液 稀释 倍数 — 1 2 4 8 1 2 4 8 — 所含内毒 素的浓度 — 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ — 平行 管数 2 4 4 4 4 4 4 4 4 2 C 2λ/检查用水 2λ/检查用水 检查用水 D 无/检查用水 — 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 方法学验证—供试品干扰试验 方法学验证— 结果判定: 结果判定: 如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度( ) 如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度(λc)均 范围内时, 在0.5λ-2.0λ范围内时,则认为供试品在该浓度下不干扰试验, 范围内时 则认为供试品在该浓度下不干扰试验, 否则需要对供试品做适当处理。 否则需要对供试品做适当处理。 干扰的排除: 干扰的排除: —对供试品进行更大倍数的稀释; 对供试品进行更大倍数的稀释; 对供试品进行更大倍数的稀释 —选择灵敏度更高的鲎试剂; 选择灵敏度更高的鲎试剂; —其他适宜的方法 如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。 如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 供试品日常细菌内毒素凝胶法检测 检测方法: 检测方法: 编号 A B C D 结果 内毒素浓度/配制内毒素的 内毒素浓度/ 平行管数 判定 溶液 无/供试品溶液 2λ/供试品溶液 2λ/供试品溶液 2λ/检查用水 2λ/检查用水 无/检查用水 2 2 2 2 阴性 阳性 阳性 阴性 无干扰浓度供试品溶液; 供试品阳性对照; 阳性对照; 阴性对照。 注:A 无干扰浓度供试品溶液;B 供试品阳性对照;C 阳性对照;D 阴性对照。 细菌内毒素检查法——凝胶法 凝胶法 ? 回顾 实验试剂、 实验试剂、仪器 及用具等的准备 确定药品的细 菌内毒素限值L 菌内毒素限值 选择鲎试剂 的灵敏度λ 的灵敏度λ 供试品的干扰试验的验 正式干扰试验) 证(正式干扰试验) 鲎试剂的灵 敏度复核 计算供试品的最大 有效稀释MVD 有效稀释 供试品日常的内 毒素限量检查 注 意 事 项 —实验前应复合鲎试剂产品的灵敏度和自身凝集时间 ∵鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求,会影响实验结果 —实验器具的洁净度符合要求 一般用硫酸清洁液浸泡4小时,用自来水冲洗干净,再用新鲜 蒸馏水冲洗三道,并干热(250℃)恒温1.5h即可。实验用的 玻璃器具必须严格无菌无热原,建议不要使用一次性朔料制品。 —实验条件 实验室要求洁净,无尘埃空气流通,若是空调室,应备有一 台超净工作台。 注 意 事 项 —温度 实验室温度为25±2℃较好,恒温水浴箱温度为37±1℃为宜。 —检查用水 选用厂家配备的BET用水,不能用注射用水替代使用。 —样品本身干扰 对含有多糖类药品,应选用特异性鲎试剂或普通鲎试剂加G 因子抑制剂使用。 对PH较低的样品应调节pH值至6.0-8。 The End 谢 谢 !