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细菌内毒素检测办法

发布日期:2022-09-28 12:07:08 来源:bob棋牌娱乐 作者:bob官方平台

  细菌内毒素检测办法 (译自英国药典 BP2004 版,同等欧洲药典 EP5 版。见原文之附录 XIV A 办法 2.6.14.) 本文所描绘的五种办法用于检测产品中是否存在细菌内毒素,而这些办法适 用于药典中的细菌内毒素的检查法--极限试验.办法的制定者期望弄清楚,如在 生产中能否下降其产品中的内毒素的含量,本篇幅中有关运用这些测验的相关方 法将在弥补的附录被供给。 细菌内毒素的检测原理是运用鲎变形细胞的溶解物来进行的(LAL试验)。 将含内毒素的溶液参加鲎变形细胞的溶解物可发生污浊、沉积或混合物的凝胶化 反响。反响速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、pH 和温度;反响要求有必定量 的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的发明,而这些都哪由鲎变形细胞的 溶解物供给。选用从染色基因肽中开释的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓 度。 下面五种办法将在后边文章中介绍; 办法 A:凝胶法;极限试验 办法 B:半定量凝胶法 办法 C:动力学污浊法 办法 D:动力学发色肽办法 办法 E:发色肽终点法 当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种办法时,那么测验的 办法便是按照办法 A 。次种办法现已得到证明,不然,产品的有用检测将会在 专门文献中特别说到。 许多专著以“细菌内毒素限制浓度”的概念给出了细菌内毒素目标,也即某 种产品所含细菌内毒素浓度不能超越限制浓度,要想证明产品符合要求,就有必要 标明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限制浓度的。 试验是运用一种能防止微生物污染的办法进行的。 检测前的预备工作中,有必要证明如下内容: 1 ——所以的设备器皿不吸附内毒素。 ——溶解物的灵敏度λ,λ是被界说为符号的溶解物敏感度或许最低内毒素 浓度被用于制造规范曲线的(定量法)。 ——搅扰素的扫除; 如有必要时,需对设备和用具进行处理,以削减其自身所带内毒素。 除非特别指明外,不然在文献中 从办法 A 到 E 中均选用相同规范。 在本篇附录中,术语阐明中包括任何其他的容器,比如一个微滴定率的极板 等。 本试验包括如下试剂和规范溶液制备: 规范细菌内毒素 BRP;与世界规范相比较,对规范内毒素 BRP 进行效准,并 以世界规范单位来标明。 鲎变形细胞溶解物:按标签所述浓度的原规范溶解物,对每一批来讲,都要 按“溶解物敏感度”中所述来确认其固有敏感度。溶解物敏感度界说为在试验条 件下能发生硬性凝胶时细菌内毒素的最低浓度,并以内毒素单位 IU/ML 来标明。 LAL 水:假如在规则的内毒素检测验验条件下,能给出一个阳性成果,那么 这种水是合格的。运用一种能有用防止夹藏水滴的设备将水蒸馏三次,就可得到 合格的 LAL 水,也能够运用其它办法制备符合要求的水。 0. 1m 的 LAL 与盐酸和 0.1M 的氢氧化钠溶液,用盐酸和氢氧化钠试剂均用 LAL 水来制备的,每种试剂都调制 pH6.0~8.0 时,在试验条件下能给出阴性成果 为合格。 除非有其它规则,试验所用溶液及稀释液皆须用 LAL 水来装备。 凝胶法 办法 A 和 B 都是运用在与溶液物混合后存在埋伏细菌内毒素的溶液中构成 凝胶的方式,这两种办法要求溶解物敏感度在其影响被确认要素后测定的。 办法 A 和 B 在是否包括比内毒素限制浓度更少的要素方面是不同的。办法 A 测验的是待测样品的仿制溶液中所含内毒素比在有关指定专著中的内毒素限制 2 浓度少,而办法 B 中待检测样品中的内毒素含量被确认为半定量,而几何学平 均内毒素浓度有必要是少于被指定在专著中的内毒素限制浓度。 在如下文章中,溶解物敏感度和搅扰要素适用于办法 A 和办法 B。 过程:取必定数量的器皿(如玻璃片或试管),在 37±℃保温,别离参加适 量溶解物,然后。按照必定的时刻距离(以能够读出各个成果为宜),顺次向每 一器皿中参加与溶解物相同量的待测溶液,并当即悄悄摇匀,不要轰动,要防止 蒸腾水分,培育反响物至于必定的、已知适宜条件的环境,时刻(一般为 20~60 分钟),然后读取成果。假如混合物构成凝胶,而且器皿悄悄翻动时不破粹,则 标明其成果为阳性;相反,假如混合物不构成凝胶,则标明其成果为阴性。 溶解物的敏感度:至少预备规范细菌内毒素 BRP 的二倍稀释的四个重复系 列浓度别离是 2λ,λ,1∕2λ,1/4λ,此处的λ是所选用的固有溶解度,要 求至少每一个的最终稀释液有必要给出一阴性成果,按照过程栏中所述,检测稀释 液和由 LAL 水组成的阴性对照溶液,然后核算出每一系列中给出阴性成果的稀释 液中所含细菌内毒素的最低浓度的对数值的平均值。这个平均值的反对数是溶解 物敏感度的估计值。假如这个数值与固有敏感度相差不超越 1/2 倍稀释因子,则 此固有敏感度便能够确认,而且有比溶解物进行的一切试验都选用这个值。 搅扰要素:溶液的 pH 有必要在特定的溶解物的限制规模内,产品的规模通 常在 pH6.0~8.0,如有必要,用 0.1mLAL 盐酸,0.1mLAL 氢氧化钠或许 适宜的缓冲溶液将待测液调至 pH6.0~8.0。 操作如“溶解物的敏感度”中所述,但预备规范内毒素BRP的稀释液是采 用待测制品中未经处理的样品,而这些样品中的内毒素是一检测不出来的。在 最大的有用稀释度(MVD)运用这些样品,比稀释度用下式核算: 最大有用稀释度(MVD)=内毒素限制浓度/溶解物的敏感度 着两个值都是以每 ml 所含细菌内毒素的世界单位来标明的。 当细菌内毒素浓度是以每 mg 产品或每世界单位产品中所含内毒素世界单 位数来标明的,此刻将内毒素限制值乘以所检溶中的浓度(以 mg/ml 或所测产 品的世界单位数/ml 来标明)得到以每 ml 所测定溶液所含内毒素的世界单位数 3 标明内毒素限制浓度。上述相关办法,适用于组成与标签共同的产品浓度。 出了欧洲药典之外的其它专著中,给定物质或待测样品的边界一般表达为细 菌内毒素的限制浓度 IU/ml(以给定物质或待测品的指定溶液),在这种情况下, 以上的核算就没有必要。 在含有待测制品情况下测